、目的要求
1. 掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。
2. 掌握培养基的配置原则和方法。
3. 掌握高压蒸汽灭菌器的操作方法和注意事项。
二、基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基：
是种应用广泛和普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有般细胞生长繁殖所需要的基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。
高压蒸汽灭菌：
主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在高压蒸汽灭菌锅内，通过加热使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。
三、操作步骤
（）玻璃器皿的洗涤和包装
1．玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。
2．灭菌前玻璃器皿的包装
（1） 培养皿的包扎：培养皿由盖底组成套，可用报纸将几套培养皿包
成包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。
（2） 移液管的包扎：在移液管的上端塞入小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作
用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1~1.5cm。塞棉花时．可用外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。
先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。
（二）液体及固体培养基的配制过程
1．液体培养基配制
（1）称量（假定配制1000ml培养基）
按培养基配方比例依次准确地称取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gNaCl放入烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。
（2）溶化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约700ml），用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积（1000ml）；如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放人已溶的药品中，再加热溶化，后补足所损失的水分。
2．固体培养基的配制
配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.5~2％)加
入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，后补足因蒸发而失去水分。
（三）培养基的分装
根据不同需要，可将已配好培养基分装入试管或三角瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱脂棉弃去。
1．试管的分装
取个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连根橡皮管，橡皮管下端再与另玻璃管相接，橡皮管的中部加弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹佐玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15×150 mm时，液体培养基可分装至试管高度1／4左有为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1／5(约3—4mI)，半固体培养基分装量为管高的1／3为宜。
2．三角瓶的分装
用于振荡培养微生物时，可在250 m1三角瓶中加入50 m1的液体培养基；若用于制作 平板培养基用时，可在250 m1三角瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉(按2％计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。 （四）棉塞的制作及试管、三角瓶的包扎
为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或三角瓶内空气预行过滤除菌。通常方法是在试管及三角瓶口加上棉花塞等。
蒸气灭菌。
使用上海申安高压灭菌器进行灭菌的过程：
1. 加水：先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面没过加热蛇
管，与三角搁架相平为宜。切勿忘记检查水位，加水量过少，灭菌锅会发生烧干引起炸裂事故。
2. 装料：放回内层锅，并装入待灭菌的物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸
汽流通而影响灭菌效果。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎的纸而透入棉塞。 3. 加盖：将盖上与排气孔相连的排气软管插入内层锅的排气槽内，摆正锅盖，
对齐螺口，然后以对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧致，勿使漏气，并打开排气阀。
4. 排气：打开电源加热灭菌锅，将水煮沸，使锅内的冷空气和水蒸汽起从排
气孔中排出。般认为当排出的气流很强并有嘘声时，表明锅内的空气已排尽，沸腾后约需5分钟。
5. 升压：冷空气完全排尽后，关闭排气阀，继续加热，锅内压力开始上升。 6. 保压：当压力表指针达到所需压力时，控制电源，开始计时并维持压力至所
需的时间。如本实验中采用0.1Mpa，121.5℃，20分钟灭菌。
灭菌的主要因素是温度而不是压力，因此锅内的冷空气必须完全排尽后，才能关闭排气阀，维持所需压力。
7. 降压：达到灭菌所需的时间后，切断电源，让灭菌锅温度自然下降，当压力
表的压力降至“0”后，方可打开排气阀，排尽余下的蒸汽，旋松螺栓，打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。压力定要降到“0”后，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基或试剂由于内外压力不平衡而冲出容器口，造成瓶口被污染，甚至灼伤操作者。
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